用户文章Sci Adv-m6A修饰与H3K27me3互作抑制炎症 | m6A专题

论文标题：Interplay of m6A and H3K27 trimethylation restrains inflammation during bacterial infection

刊登日期：2020年8月                   

发表杂志：Science Advances

影响因子：13.116

研究机构：中山大学中山医学院赵蔚课题组

开展项目：m6A测序

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摘要

虽然细胞中各种生化反应中mRNA属于最普遍修饰之一，但其在调节细菌诱导的炎症反应中的机制仍然未知。

来自中山医学院的赵蔚课题组发现，m6A reader YTHDF2促进了组蛋白H3K27me3的去甲基化，从而导致促炎性细胞因子的产生增强，并促进了m6A共转录的沉积。从机理上讲，KDM6B的mRNA被m6A修饰，其降解由YTHDF2介导。YTHDF2表达降低能够提升KDM6B的mRNA稳定性，以促进多种促炎细胞因子的H3K27me3去甲基化，继而增强了它们的转录水平。

此外，赵蔚课题组还确定H3K27me3作为转录过程中m6A修饰的障碍（barrier）。KDM6B募集m6A甲基转移酶复合物，以通过去除相邻的H3K27me3障碍继而促进转录mRNA时m6A的甲基化修饰。

这些结果揭示了细菌感染过程中m6A与H3K27me3之间的cross-talk，这对于破译免疫稳态中的转录组学具有更广泛的意义。

YTHDF2敲除增加细菌感染过程中促炎性细胞因子的产生

作者一开始使用ELISA（使用酶标仪法）检测了鼠伤寒沙门氏菌（HKST）感染前后THP-1细胞中mRNA的总体m6A水平，结果表明细菌感染后mRNA的总体m6A水平显着升高，其中WTAP作为writer表达显著增加。与未经处理的KO细胞相比，HKST处理后WTAP KO THP-1细胞中mRNA的m6A修饰没有改变。

接下来，作者锚定m6A阅读蛋白YTHDF2作为研究的关键蛋白，对mRNA降解起到关键作用。YTHDF2 KO的THP-1细胞表现出各种促炎细胞因子基因的表达水平上调。这些数据表明，YTHDF2 KO促进了细菌感染引起的炎症反应。

HKST刺激后，YTHDF2 KO THP-1细胞中IL6和IL12B的mRNA和蛋白的表达水平明显高于WT THP-1细胞中的IL6和IL12B的mRNA和蛋白的表达水平。

此外，YTHDF2 KO显着增强了LPS、Pam3CSK4、CL097这三种TLR家族的表达水平。但是刺激的THP-1细胞中IL-6的mRNA和蛋白表达水平作用不大。过表达YTHDF2结果相反。

这些结果表明，YTHDF2在人细胞中的细菌感染过程中抑制了促炎细胞因子的一个亚群，例如IL-6。

细菌感染会增加组蛋白修饰相关转录本的m6A水平

作者通过转录组测序发现，NF-κB和MAPK信号通路中p65、p38、JNK及ERK等磷酸化及表达水平与HKST处理组比较相似。

接下来作者对YTHDF2蛋白中m6A识别的结构域进行突变后发现，YTHDF2突变体对IL-6的mRNA 表达及蛋白有负调节作用，换句话说YTHDF2能够促进IL-6的mRNA 降解。

以上结果表明YTHDF2对促炎症细胞因子有负调节作用。

使用m6A测序（由联川生物提供m6A测序服务）绘制了HKST处理的WT及YTHDF2 KO的THP-1细胞m6A甲基化图谱。GO富集分析表明，m6A peak有大量组蛋白修饰相关的基因通路差异显著富集。

YTHDF2-RIP-seq表明，超过60%的peak与m6A测序中的peak有重叠，包括组蛋白修饰相关通路。但有趣的是，RIP测序结果中YTHDF2没有直接结合促炎细胞因子IL6 mRNA。

YTHDF2结合的mRNA和m6A上调的基因的共同分析表明，这些基因都与组蛋白修饰功能相关，这表明m6A在通过调节组蛋白修饰基因来调节细菌感染引起的炎症中具有重要作用。

综上所述，组蛋白修饰相关基因mRNA的m6A修饰显着增加，并被细菌感染YTHDF2 binding。

YTHDF2抑制细菌感染过程中IL6启动子的H3K27me3去甲基化

通常，激活基因的转录起始位点用三甲基化的H3K4（H3K4me3）或乙酰化的H3K27（H3K27ac）来标记，而抑制基因转录活性则用H3K27me3标记。

YTHDF2 KO THP-1细胞中H3K27me3的总体水平显着低于WT对照，而响应HKST、YTHDF2 KO和WT细胞中H3K4me3和H3K27ac的总体水平相似。

此外，ChIP-seq和ChIP qRT-PCR分析显示，YTHDF2 KO THP-1细胞中促炎细胞因子基因启动子（IL6，IL12B，ICAM1和CCL22）的H3K27me3修饰明显低于WT THP-1细胞。相反，响应HKST刺激，YTHDF2 KO和WT THP-1细胞在促炎细胞因子启动子的H3K4me3修饰水平上没有显着差异。

这些数据表明，在细菌感染过程中，YTHDF2 KO通过促进其启动子处的H3K27me3去甲基作用，增强了促炎细胞因子如IL-6和IL-12B的表达。

KDM6A和KDM6B被鉴定为H3K27去甲基酶，可催化H3K27me3去甲基修饰。WB和ChIP-qPCR表明，在有或没有HKST刺激的情况下，KDM6B表达降低增强了IL6启动子的整体H3K27me3修饰和H3K27me3修饰。所以KDM6B的低表达显著降低了IL-6的mRNA和蛋白表达水平。

为了进一步证实KDM6B在YTHDF2介导的炎症反应中的作用，作者构建了YTHDF2和KDM6B 双敲（dKO）THP-1细胞。在正常和HKST刺激的条件下，KDM6B KO都能补救YTHDF2 KO，降低IL6启动子的H3K27me3修饰。但是，IL6启动子的H3K4me3修饰在KDM6B和YTHDF2 dKO细胞中不受影响。

因此，与YTHDF2的KO相比，KDM6B和YTHDF2的dKO不能促进IL-6的转录。这些结果表明，KDM6B的KO可以补救细菌感染期间YTHDF2 KO THP-1细胞中促炎性细胞因子mRNA的上调。

YTHDF2识别m6A修饰的KDM6B并介导其降解

RIP-seq表明在HKST刺激后，KDM6B有peak峰，但KDM6A没有peak峰。RIP-qPCR分析表明，YTHDF2能够与KDM6B mRNA结合，并且这种结合在响应HKST刺激后显着增强。qRT-PCR和WB进一步证实，YTHDF2 KO显着增加KDM6B的mRNA和蛋白质表达水平。YTHDF2敲低（YTHDF2 siRNA）结果也相似。

这些证据表明，YTHDF2对m6A修饰的KDM6B mRNA的识别可抑制KDM6B的表达。

接下来，作者对YTHDF2识别m6A的结构域进行突变，使用放线菌酮来检测KDM6B的mRNA半衰期。KDM6B mRNA表达增加是由于在YTHDF2 KO细胞中对m6A修饰的RNA无法识别继而导致的mRNA衰减降低，反过来说WT中YTHDF2能够识别KDM6B的mRNA导致其衰退或降解速度加快。

接下来，作者在小鼠巨噬细胞中测试了Ythdf2对II6产生的调控是否保守。与人类细胞中发现的不同，用小鼠Ythdf2 siRNA转染鼠巨噬细胞对Il6表达没有影响。

此外，作者分析了小鼠细胞Ythdf2-CLIP-seq数据，发现小鼠Ythdf2的结合mRNA与人细胞中的结合mRNA完全不同。Ythdf2无法识别小鼠Kdm6a / 6b mRNA中的m6A峰。

所以支持YTHDF2只能在人细胞中特异性介导KDM6B的mRNA加工，而在小鼠中无法行使相似功能。

m6A修饰KDM6B mRNA在YTHDF2 KO细胞中更稳定

m6A测序结果表明，KDM6B mRNA在CDS区域有m6A peak峰信号。当使用HKST处理时，m6A甲基化水平增加。

作者将690 nt的WT和突变CDS克隆到Rluc报告基因中。与m6A修饰在调节KDM6B mRNA稳定性中的功能一致，在正常条件下，突变的Rluc活性比WT的Rluc活性高。

YTHDF2的异位表达实质上抑制了WT报告基因的Rluc活性，并且该抑制作用因m6A共有位点的突变而减弱。

因此，通过YTHDF2过表达，KDM6B-WT-luc（而不是KDM6B-MUT）的相对Rluc mRNA水平大大降低。

YTHDF2的KO增加了WT的Rluc活性并延缓了mRNA的降解，但没有使突变报告基因的mRNA降解。

此外，作者通过将WT和突变CDS序列分别克隆到MSCV的逆转录病毒载体中，分析了KDM6B转录物的稳定性。突变的KDM6B mRNA比WT KDM6B mRNA更稳定，这表明这四个A碱基的m6A修饰对于调节KDM6B mRNA的稳定性至关重要。

最后，THP-1细胞中m6A位点的突变阻止了YTHDF2在KDM6B mRNA上的结合。

总之，这些数据表明，将YTHDF2与KDM6B mRNA结合以及YTHDF2介导的KDM6B mRNA降解需要KDM6B CDS中在2439、2461、2837和3065上的m6A修饰。

KDM6B招募m6A Writers复合物并通过共转录促进m6A修饰

之前陈建军课题组报道称，H3K36me3通过转录共介导m6A修饰。为了确定H3K27me3去甲基在m6A修饰的动态调节中的作用，作者比较了THP-1细胞转录组中H3K36me3和H3K27me3修饰与m6A的全基因组分布。

作者发现，在HKST处理的THP-1细胞中，HH3K27me3峰的位置与m6A和H3K36me3峰的位置是互斥。m6A信号的分布主要在H3K27me3阴性染色质区域。H3K27me3去甲基酶KDM6B的KO导致HKST处理后mRNA的整体m6A修饰水平下降。

m6A-seq分析表明，与WT对照相比，KDM6B KO THP-1细胞终止密码子周围的m6A信号显着下调。在KDM6B KO细胞中，m6A修饰轩主降低的基因主要集中在染色质修饰的调控上。

GSK-J4对H3K27me3脱甲基酶的抑制作用还导致mRNA上m6A整体修饰降低（图6E）。此外，H3K27me3去甲基酶KDM6B的mRNA表达与正常组织中的m6A甲基转移酶复合基因（METTL3/METTL14/WTAP）正相关。这些结果暗示H3K27me3是m6A修饰累积的barrier，并表明H3K27me3功能的缺失促进了m6A甲基化。

作者进一步使用GSK-J4抑制H3K27me3去甲基修饰作用，并研究了H3K27me3去甲基修饰对KDM6B基因座上m6A修饰积累的调节作用。GSK-J4处理抑制了m6A修饰积累，并随后阻碍了YTHDF2与KDM6B mRNA的结合。

mRNA表达水平由RNA产生和降解的相互作用决定。尽管GSK-J4抑制了KDM6B的转录，但由于抑制了m6A和YTHDF2介导的mRNA，GSK-J4处理仍提高了THP-1细胞和PBMC中KDM6B的mRNA水平的衰减（图6J）。

作者发现通过GSK-J4处理实验，在HSKT诱导的THP-1细胞和PBMC中的炎症过程中，IL6转录水平的激活需要H3K27me3去甲基作用。

从机制上讲，作者用过ChIP-qPCR发现KDM6B与METTL3/METTL14互作。此外，通过GSK-J4抑制H3K27me3去甲基化修饰表明，KDM6B去甲基酶活性的减弱降低了METTL4在KDM6B基因位点上的结合，这表明H3K27me3去甲基化修饰对于m6A甲基转移酶复合物的招募至关重要。

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